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如何能把ELISA实验做好？操作过程中的注意事项！！
2020-06-30 浏览次数：2070
1. 试剂盒使用前室温平衡20-30分钟
温度是ELISA结合反应的重要影响因素，为使所有样本在一致的温度下反应，实验前务必将所有的试剂平衡至室温，包括检测样本，避免因温度的动力学反应差异而导致ELISA检测结果的不准确。若无该过程，可能导致一些弱阳性样本出现假阴性。
2. 规范加样：不规范的移液操作可能带来0.1%到5%的移液误差，甚至更高！
a. 移液器定期校准：选择密封性好质量可靠的吸头，吸量不准确，直接影响检测结果；
b. 加样前，溶液充分混匀，垂直悬空加入液体，避免加在孔壁上，不可产生气泡；
c. 加样时避免液体溅出，如有样本溅出，应用吸水纸轻轻拭干，并做相应记录；
d. 如果加样枪漏气以至于加样的量不够，不能用枪吸出再加，做相应记录实验；
e. 每次加样顺序一致，尤其底物、终止液顺序一致，保证每个孔显色时间相同。
3. 标准品的溶解与稀释，严格按说明书要求进行。
a. 粉末标准品短暂离心，让因运输沾到管盖、管壁的标准品沉到管底。
b. 根据瓶标签加入一定体积的蒸馏水(或说明书溶液），加水后轻柔涡旋震荡，室温静置溶解10-30分钟，让粉末*溶解。
注意：加水(或说明书溶液）后暂不用移液枪吹吸，避免蛋白未溶解，枪头带出部分蛋白，待*溶解后可吹吸或涡旋振荡混匀。
4. 标准品和样本做复孔
复孔的目的在于：可以计算检测结果平均值，使实验结果更准确；通过复孔结果对比，评估试剂盒的精密度及实验中是否存在误操作；
5. 震荡操作
a. 孵育过程震荡，可以加快、加强抗原抗体之间的相互碰撞接触，使得反应更加*，OD值通常比未震荡孵育的结果要高；
b. 洗涤过程中震荡，可以使洗板更干净，很大程度上降低背景值，同时提高试剂盒检测的灵敏度。
6. 洗涤操作
a. 手工洗板，拍板时要垂直，避免交叉污染，用力不能过猛，防止抗原抗体复合物脱离；
b. 机器洗板应经常检查冲洗头是否畅通，若被杂物堵塞可用注射器针头挑出。
c. 扣干后的酶标板应立即加液，不能干板太久。
7. 显色判断
说明书中提供的显色时间仅为经验，具体时间需随时注意观察。通常高浓度的标准品颜色不再变深，S1、S2、S3有明显梯度，S5有淡蓝色，或者标准品S1孔在630 nm的OD值在0.5-0.7、S5孔的OD值达到0.05-0.08，可以终止反应。
8. 检测
a. 酶标仪使用前务必预热10-15分钟，使结果更稳定；
b. 采用双波长测定吸光值，排除单波长检测时的测定干扰（样本的干扰、干扰色等）。一般采用大波长为参考波长，在参考波长630 nm(570 nm)下，检测物的吸光值小，检测波长450 nm和参考波长630 nm(570 nm)的吸光值之差可以消除非特异性吸收，双波长测定，可以大限度的消除指纹、杂质及不透光的物质对酶标仪读数带来的误差，以保证实验数据的准确度。
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