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流式样品制备过程

2015-03-12 浏览次数：2816

流式细胞以检测分析的对象是细胞或者细胞样颗粒性物质，所以流式细胞术是细胞学的重要研究手段之一下面我们介绍一下用于流式细胞仪分析的单细胞悬液。

独立细胞样品的制备

如果是是悬浮细胞则直接收集细胞于离心管，离心沉淀细胞，用PBS重悬洗一次，然后固定待测，或取适量细胞与EP管中，标记相应的荧光偶联抗体，zui后吸取未结合的抗体，然后固定待测。
如果细胞是贴壁细胞，需要胰酶消化细胞适当时间后，用移液器反复吹打，收集待测样品细胞，离心后固定，或标记抗体。
- 将培养细胞用0.25%的胰蛋白酶消化，至显微镜下见到贴壁细胞回缩变圆为止，弃掉消化液，加入PBS用吸管将细胞从瓶壁上轻轻吹打下来，并移入离心管中。
- 短时低速离心，即1000r/min离心5min
- 弃上清，加pH 7.4的PBS液洗2次，1000r/min离心5min，以去除细胞悬液中的细胞碎片
- 加入固定液固定或低温保存待用。
如果研究对象是外周血，根据目标细胞的不同可以有两种处理方法。如果研究对象是外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）,zui常用的提取方法是Ficoll-hypague密度梯度离心法。

Ficoll-hypague密度梯度离心法分离PBMC：

抽取适量的血液于离心管中，该离心管必须事先加上抗凝剂，防止血液凝固。
用PBS稀释血液，稀释倍数可以根据血液的稠度加以调整，一般以2-4倍为宜。
根据血液的总量选用15ml离心管或者50ml离心管，先加入离心管1/4体积的Ficoll分离液，然后慢慢将稀释后的血液小心叠加到Ficoll分离液的上层，体积是Ficoll液体积的2.5-3倍为宜。注意叠加血液时一定要轻柔，避免加入的血液与Ficoll液相混合，这一步很关键，如果血液层与Ficoll液层互相混合，就无法成功分离PBMC
将离心管在水平离心机中离心，2000r/min离心30min。
取出离心管，此时离心管内的液体分为三层，上层为血浆，中层为含PBMC的Ficoll液，zui下层为红细胞，注意此时要轻拿轻放，切勿将分层的液体重新混匀。PBMC主要位于Ficoll液的上层，即血浆与Ficoll液层的交界处，肉眼见到的混浊絮状物就是PBMC，用吸管小心吸取中层的Ficoll液，尽量吸尽其中的混浊絮状物，吸入少量血浆不会影响结果，但需避免吸入zui下层的红细胞。