PINP ELISA试剂盒说明书

一.PINP ELISA试剂盒【预期用途】
本试剂盒应用双抗体夹心酶联免疫分析方法，用于定量测定人血清或羊水样本中I型原胶原N端前肽(PINP)。仅用于科学研究。

二.PINP ELISA试剂盒【概要说明】
I型胶原的生成是骨形成过程中的一个重要步骤，它是骨基质中的主要有机成分。I型原胶原氨基端前肽(PINP)来源于胶原合成过程中与胶原同等数量的1型原胶原分子。在胶原合成中，前肽是从与胶原等分子浓度的前胶原分子N端和C端末裂解下来的。因此，定量测定PINP可测定胶原合成和/或骨形成状态。

本试剂盒识别的人PINP特异性序列，只在骨形成过程中释放，不与肝纤维化诱导的I型胶原合成交叉，同时与人的PIINP、PIIINP同源序列交叉反应小于5%。

三.PINP ELISA试剂盒检验原理：

本试剂盒采用双抗体夹心酶联免疫方法。利用生物素标记的小鼠抗PINP单克隆抗体包被至链酶亲和素预包被微孔板的孔内。标准品、质控品和样本加入到微孔后，再加入辣根过氧化物酶标记的小鼠抗PINP单克隆抗体，然后室温下孵育1小时，接着吸出孔内液体并洗涤。zui后加入显色底物(TMB)进行显色。将加入了终止液的混合液体置于酶标仪上读取吸光度，颜色强度与PINP浓度成正比。
【组成成分】
1.Standard A‐标准品A
含有PINP的胎牛血清的冻干粉。
标准品A的浓度为780 ng/ml，每瓶用4.5ml的蒸馏水或去离子水重悬。
2.Streptavidin Coated MTP‐链霉亲和素预包被微孔板
孔内预包被链酶亲和素的微孔板，12×8孔条，包装于带干燥剂的铝箔袋中。
3.Biotinylated P1NP Antibody‐生物素标记的抗P1NP抗体
含有生物素标记的PINP抗体的蛋白稳定剂的磷酸缓冲盐，每瓶0.2ml。
4.POD Conjugated Antibody‐酶结合物
含辣根过氧化物酶标记的小鼠单抗、酶稳定剂和防腐剂的磷酸盐缓冲液，每瓶0.2ml。
5.Substrate Solution‐底物液
含有四甲基联苯胺(TMB)和过氧化氢的溶液，每瓶12 ml。
6.Stopping Solution‐终止液
0.3M 稀硫酸，每瓶12ml。
7.Incubation Buffer‐孵育缓冲液
含蛋白稳定剂的磷酸盐缓冲液，每瓶30ml。
8.Washing Solution‐洗液
含有吐温的50×Tris盐缓冲液，每瓶20ml。
9.Sealing Tape‐封板膜
4张/盒。

四.PINP ELISA试剂盒【储存条件及有效期】
2‐8°C下保存12个月。

五.PINP ELISA试剂盒【适用仪器】
适用于具有450nm、650nm波长的所有全自动、半自动酶标仪。

六.PINP ELISA试剂盒【样本要求】
采用人血清或羊水样本。样本收集后应尽快分离，长期储存需置于‐20°C下，避免样本反复冻融。整个实验应使用相同的样本类型。

七.PINP ELISA试剂盒【检验方法】
1.自备材料：
1)可移取10μL，20μL和100μL的高精度移液器
2)可移取100μL的高精度多道移液器
3)酶标板振荡器
4)自动洗板机（可选择）
5)酶标仪和数据分析软件
2.试剂准备：
1)Standards‐标准品
将Standard A用Incubation Buffer按照2倍梯度往下稀释5个点(Standard A‐E)，Standard F为Incubation Buffer，即零浓度。
2)Biotinylated P1NP Antigen‐生物素标记的P1NP抗体
将其按照1:100稀释于Incubation Buffer中（现用现配），室温下静置10分钟，混合均匀后使用。
3)POD Conjugated Antibody‐酶结合物
将其按照1:100稀释于Incubation Buffer中（现用现配），室温下静置10分钟，混合均匀后使用。
4)Washing Solution‐洗液
每瓶冲洗浓缩液按照1:50加入至蒸馏水或去离子水中混匀，室温下保存。
备注：所有其他试剂可直接使用，但在检测前应将其恢复至室温，反复倒转使其混合均匀。
3. 操作步骤：
1)加入100μl稀释过的生物素标记P1NP抗体于所需数量的酶标板微孔内，盖上封板膜，在酶标板振荡器(300转每分钟)上于20‐25°C下孵育30±5分钟。
2)用稀释好的洗液洗板5次。
a)自动洗板：设置洗板机分配每孔至少250μl冲洗液。重复5次，于吸水纸上用力拍打倒置的板以去除残留的冲洗液。
b)手工洗板：迅速颠倒倒出孔内物。每孔加入250μl冲洗液，迅速甩掉孔内洗液，于吸水纸上用力拍打倒置的板以去除残留的洗液。再重复此过程4次。
3)加入50μl标准品和样本于相应的酶标板微孔内，每个做双孔。然后再用多道移液器向所有微孔内加入50μl的incubation buffer（注：该操作应在15分钟内完成以减少误差）。
4)盖上封板膜，在酶标板振荡器(300转每分钟)上于20‐25°C下孵育60±5分钟。
5)用稀释好的冲洗缓冲液洗板5次。
6)加入100μl新鲜配制的酶结合物溶液
7)盖上封板膜，在酶标板振荡器(300转每分钟)上于20‐25°C下孵育60±5分钟。
8)用稀释好的冲洗缓冲液洗板5次。
9)用多道移液器于每孔内加入100μl TMB底物。
10)盖上封板膜，在酶标板振荡器(300转每分钟)上于20‐25°C下孵育15分钟。
11)用多道移液器于每孔内加入100μl终止液。
12)加入终止液后，30分钟内在酶标仪450nm（参考650nm）波长处读取吸光度。